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[医学资讯] 新的色谱技术可以提高我们对逆转录病毒感染的理解

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发表于 2019-3-12 00:05:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
由于它们同时表达,包膜病毒样颗粒(VLP)和细胞外囊泡(EV)难以区分和分离用于分析目的。除了它们的共表达,EV和VLP表现出形态学,生物物理学和分子相似性。为了解决这一分离挑战,研究人员最近设计了一种两步色谱法,可以分离VLPs和EV进行精确分析。

HIV病毒的例证,最著名的retrovirusesRalwel |之一存在Shutterstock

开发分离VLP和EV的方法的主要动机之一是进一步了解HIV等逆转录病毒感染。虽然确实存在病毒纯化方法,例如密度梯度离心,超滤或尺寸排阻色谱,但这些方法在分离EV和VLP的能力方面证明是低效的。

该新技术基于先前使用肝素亲和层析作为分离VLP和EV的替代方法的工作。通常,哺乳动物细胞培养上清液中高水平的肝素结合蛋白在该一步法中竞争结合位点。

新的两步法能够在没有任何竞争的情况下分离两种颗粒。该研究可为大规模病毒学研究铺平道路,研究EV和VLP的生物学作用。

方法

在Alois Jungbauer博士的带领下,该研究的研究人员开发了一种两步色谱纯化技术,首先从HEK 293细胞中收集HIV-1 gag VLPs和EVs。然后处理细胞,收集上清液并装入装有核 - 壳珠的柱子中。

然后通过肝素亲和层析在第二步中进一步纯化从柱中收集的流体级分。然后在肝素亲和过程后收集第二组流体级分并分析总蛋白和双链DNA(dsDNA)含量。

用于分离,定量和分析蛋白质含量的分析技术包括Bradford测定,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),Western印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。

通过使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)成像进行进一步的颗粒表征和尺寸分布分析。

结果

在收集的液体部分中发现EV的浓度显著更高,而在洗脱峰中发现了VLP。不仅新技术能够准确地分离两种分子,还观察到VLP和EV在整个色谱过程中保持完整的球形。

展望

使用这种技术,研究人员能够证明两步法可以将VLP和EV分开,从而可以单独研究它们。他们希望这种快速和可扩展的技术可以应用于未来大规模生产VLP和EV,以更深入地了解这些分子的生物学功能。

来源:
Reiter, K., Aguilar, P. P., Wetter, V., Steppert, P., Tover, A., & Jungbauer, A. (2019). Separation of virus-like particles and extracellular vesicles by flow-through and heparin affinity chromatography. Journal of Chromatography A; 1588; 77-84.
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