王晓军 罗向东 罗勤 杨宗城
【摘要】 目的 研究中性粒细胞在肝脏中的聚集、滞留机制及参与肝细胞损伤的作用。方法 应用生物力学技术、流式细胞技术等方法,观察了烧伤病人血清对培养人肝细胞和肝窦内皮细胞间粘附力,以及P-选择素及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在两种细胞中表达情况的影响。结果 (1)严重烧伤后早期中性粒细胞在肝脏中有聚集;(2)肝细胞和中性粒细胞在烧伤血清作用下粘附力以2小时为最强;(3)肝细胞正常情况下无P-选择素和ICAM-1表达,烧伤血清作用后ICAM-1表达增强。肝窦内皮细胞在正常情况下有少量P-选择素和ICAM-1表达,烧伤血清作用后表达增加。结论 严重烧伤后中性粒细胞在肝脏中的渗出和聚集及加重肝脏功能损害,是中性粒细胞、细胞因子和粘附分子协同作用的结果。
【关键词】 烧伤 中性粒细胞 粘附力 P-选择素 细胞间粘附分子-1
Study on Mechanism of Neutrophil Aggregation in Liver and Its Effect on Hepatocytic Injury WANG Xiao-jun, LUO Xiang-dong, LUO Qin, et al. Burn Research Institute, Southwestern Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Aim To study the mechanism of neutrophil aggregation in the liver and its effect on hepatocytic injury after severe burns during early postburn phase. Methods The change of intercellular adhesive force between neutrophils and hepatocytes, and the changes of the expression of P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) on the hepatocytes and hepatic sinusoidal endothelial cells (HSECs) were observed dynamically with flow cytometry and micropipette aspiration system under the influence of the burn patient's serum. Results (1)There were polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in the liver at the very early stage after burn. (2) In the presence of burn patient's serum, the intercellular adhesive force between neutrophils and hepatocytes reached its top level at 2 hour after co-cultivation. (3) There were no P-selectin or ICAM-1 expression in the normal hepatocytes. Under the influence of burn patient's serum, the expression of P-selectin increased significantly in HSECs but not in hepatocytes,and the expression of ICAM-1 increased significantly in hepatocytes and HSECs. Conclusion The synergistic role of neutrophils, cytokines and adhesion molecules is to creat the extravasation, aggregation and the toxic effects of the neutrophils in the liver after severe burns.
【Key words】 Burns Neutrophil Adhesive force P-selectin Intercellular adhesion molecule-1
严重烧伤后早期中性粒细胞在肝脏中的聚集、滞留,是加重肝细胞损伤的主要因素。笔者进行载体及体外细胞复合培养,动态观察了烧伤病人(面积50%以上、Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞和中性粒细胞间粘附力的影响,P-选择素和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在两种细胞中表达的影响,以期探讨中性粒细胞在肝脏中的聚集机制及其对肝细胞的损伤。
材料与方法
1.大鼠烧伤模型制作:选用健康Wistar大鼠25只,体重(250±330)g,随机分为正常对照组(鼠数=5)和烧伤组(鼠数=20),设4个时相点(2,6,12,24小时),每时相点5只,烧伤组用本所常规方法造成30%TBSAⅢ度烧伤(病理切片证实),伤后腹腔注射等渗盐水0.04ml/g体重抗休克,正常对照组除不烧伤外,其他处理相同。
2.肝组织中髓过氧化物酶(MPO)测定:见参考文献［1］,单位10μmol.s－1.L－1。
3.形态学观察:在烧伤后以上时相点取肝脏各一块,苏木素和伊红(HE)染色后观测。
4.人肝细胞和窦状内皮细胞的培养:见参考文献［2］,以2×105/ml接种于六孔培养板中,在37℃,5%CO2孵箱内培养,肝细胞培养4天,肝窦内皮细胞培养8天开始实验。
5.人烧伤血清的获得:50%以上Ⅱ～Ⅲ度烧伤病人,伤后48小时内抽血分离血清,56℃、30分钟灭活补体制成20%的烧伤血清1640合成培养液。
6.中性粒细胞的分离纯化:在开始实验前2小时抽正常人血,用等量的淋巴细胞分离液离心4000～6 000g 30分钟取中层中性粒细胞,用梯度浓度溶解残留的红细胞,纯化中性粒细胞,涂片染色证实为中性粒细胞,其纯度和存活率大于95%。
7.肝细胞和中性粒细胞粘附力的测定:培养4天完全附壁于培养腔的肝细胞,放入已分离纯化的中性粒细胞,分正常对照组和烧伤血清作用组,以孵育1,2,6,12,24小时运用微管吸吮系统测定将中性粒细胞从肝细胞上拉开的拉力,用公式Fa=△P×πRP2(其中Fa:粘附力,△P:100×mm H2O,Rp:微管的直径)计算粘附力。
8.肝细胞、肝窦内皮细胞中P-选择素和ICAM-1表达的检测(流式细胞术):将培养4天的肝细胞和培养8天的肝窦内皮细胞分成两组,即正常对照组(不加烧伤血清)和实验组(加入烧伤血清),设1,2,6,12,24小时五个时相点,用胶原酶消化2～3分钟,将附壁的细胞游离,用PBS液离心清洗,加入适当稀释的P-选择素单抗(苏州医学院血栓病研究所)和ICAM-1单抗(德国宝灵曼公司),在4℃冰箱中孵育30分钟,PBS液清洗后加入相应的荧光抗体,在4℃冰箱中孵育30分钟,PBS清洗后上机检测。
9.统计学处理:以均值±标准误(±s)表示,采用t检验。
结 果
1.烧伤后大鼠肝脏中MPO活性的变化(表1)。
表1 30%TBSAⅢ度烧伤大鼠肝脏中MPO活性的变化(μmol.s－1.L－1,±s)(鼠数=5)
烧伤后时间(h) 0 2 6 12 24
MPO活性 0.13±0.03
0.25±0.08**
0.32±0.11**
0.23±0.07**
0.29±0.12**
与烧伤前(正常对照)比较,**P<0.01
2.光镜显示:从6小时开始至24小时检测的三个时相点肝组织中荻氏间隙增宽,并可见大量的中性粒细胞和单核细胞进入其中。
3.烧伤血清对肝细胞和中性粒细胞粘附力的影响(表2)。
表2 烧伤血清对培养的人肝细胞和中性粒细胞粘附力的影响(mN×10－6,±s)(鼠数=10)
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