阎明 党耕町
【摘要】 目的 探讨以块状多孔羟基磷灰石（HA）作为软骨细胞培养的载体，构建一种促进骨愈合的植入材料的可行性。 方法 采取成年雄性SD大鼠肋软骨细胞，以3 mm×3 mm×4 mm大小的块状多孔HA为载体培养软骨细胞；培养3天和7天后通过扫描电镜观察HA表面和中矢横断面孔隙中有无细胞生长，同时将培养2天的细胞爬片以α1（Ⅱ）cDNA片段为探针进行原位杂交，求证培养的细胞是否软骨细胞。 结果 细胞爬片原位杂交染色强阳性，证实是软骨细胞，且HA表面和中矢横断面孔隙内壁上均有细胞生长，随培养时间增加细胞数明显增加。 结论 HA可以作为细胞培养的贴壁底物，软骨细胞可以长入多孔HA内部的孔隙中。
【关键词】 羟基磷灰石类 软骨 细胞，培养的
Construction of porous hydroxyapatite（HA）block loaded with cultured chondrocytes
YAN Ming，DANG Gengting.
Department of Orthopaedic Surgery,Third Teaching Hospital，Beijing Medical University，Beijing 100083．
【Abstract】 Objective To construct a kind of bone healing enhancing implant with cultured chondrocytes bound to hydroxyapatite（HA）. Methods Chondrocytes were obtained from the costicartilage of rat and were cultured on the porous HA blocks, 3 mm×3 mm×4 mm size, for three and seven days. Scanning electron micrograph was taken to show whether the cells grew outside and inside the pore of HA block. The cells cultured on tiny glass sheet for 2 days were used to prove where the cells come from by in situ hybridization technique with α1(Ⅱ)cDNA probe. Results Scanning electron micrographs showed that the pores of the HA surface and inside of the blocks are filled with cultured cells,especially the longer cultured block. The cells were chondrocytes confirmed by in situ hybridization. Conclusion The porous HA can be used as cell cultured substrate and chondrocyte can adhere and proliferate inside the porous HA block.
【Key words】 Hydroxyapatites Cartilage Cells,cultured
临床治疗骨折、骨缺损以及进行关节融合时,常需要在局部植入促进骨愈合的材料。自体松质骨是目前最理想的植入材料，但其来源有限，而且需手术切取，有造成手术并发症之虞。寻找其它理想的植入材料，一直是人们追寻的目标。我们根据组织工程学原理，选择软骨细胞和块状多孔羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)，试图构建一种成骨材料，现将实验结果报告如下。
材料和方法
1．实验材料：羟基磷灰石［Ca10(PO4)6(OH)2］，加入5%MgO和5%Sic(n)以增加其强度和韧性；烧结温度1?200 ℃，含孔率50%，孔径100～300 μm，大小为3 mm×3 mm×4 mm。样品由清华大学精细陶瓷实验室提供。实验动物为成年雄性SD大鼠，体重250克。培养液为DMEM（高糖型）加15%胎牛血清。
2．细胞培养：将大鼠麻醉后在无菌条件下切取其第4～6胸肋（软骨）3～4段，每段长约5 mm，不含软骨膜，用D-Hanks液洗净血污，置入0.1%透明质酸酶中消化（37℃，15分钟）；彻底剔净软骨膜，弃消化液，加入0.1%Ⅱ型胶原酶消化（37℃，4小时）后，弃消化液，重新加入0.1%Ⅱ型胶原酶消化（37℃，19小时），离心(1?000 r/min，5分钟)，弃消化液，用不含血清的DMEM培养液重悬细胞，离心(1?000 r/min，5分钟)，弃上清夜，重复3次，然后收集细胞，移入培养瓶中，加适量培养液，放入培养箱中培养（37 ℃，5% CO2）。原代培养10天，细胞贴满瓶底，开始传代，用0.25%胰酶消化。将高压灭菌消毒的块状HA置入小瓶中，在负压状态下加入细胞悬液，以便液体进入HA内部孔隙中，然后将HA和细胞悬液一起移入24孔培养板中，细胞密度1×105/ml，同时将8 mm×8 mm大小的无菌洁净盖玻片放入另外的孔中，加入细胞悬液和适量培养液（2天后取出，用丙酮/甲醇固定，留做细胞鉴定用）放入培养箱中培养（37℃，5% CO2）。分别于3天和7天将HA取出，鉴定细胞有无长入。
3.细胞的鉴定：(1)原位杂交技术：以α1（Ⅱ）cDNA片段为探针，检测有无软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原mRNA表达。将盖玻片取出后经固定液固定，按细胞爬片原位杂交的方法进行染色，同时做阴性实验对照。(2)扫描电镜观察：分别将3天和7天培养的HA取出，沿中央横断面切开，经戊二醛和饿酸固定，梯度酒精脱水，临界点干燥喷镀，镜下观察HA表面和中央横断面孔隙中细胞的生长情况。
结 果
1.原位杂交：细胞爬片显示细胞胞浆内有较强的染色信号(图1)，阴性对照实验则未见染色，说明细胞内有较强的Ⅱ型胶原mRNA表达，Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特征性产物，从而说明培养的细胞确是软骨细胞。
图1细胞爬片a1ⅡcDNA探针原位杂交染色×20
2.倒置显微镜镜下观察：随着培养时间的增加，培养板中贴壁的细胞与HA块表面生长的细胞逐渐相连、融合。
3.扫描电镜观察：细胞培养3天和7天的HA，无论表面还是中央横断面孔隙内壁上，均有细胞生长，培养时间越长，细胞越多，表面的细胞明显多于中央横断面（图2）。
图2HA中矢横断面扫描电镜图象(细胞培养7天)
讨 论
促进骨愈合的生物学方法主要是局部植入各种材料。这些材料根据其成骨过程的作用分为三种:(1)骨传导（osteoconduction）；(2)骨诱导（osteoinduction）；(3)骨生成（osteogenesis）。骨生成材料中除含有少量活性生骨细胞外，还具有骨传导和骨诱导的作用，所以，是目前比较理想的促进骨愈合的植入材料，其中尤以自体松质骨为首选，但其来源有限。异体和(或)异种骨移植由于免疫排斥和可能发生传染病而受到限制［1］。近年来，随着组织工程学的发展，人们在体外构建活性组织材料，再植入体内以达到修复、重建器官组织的目的［2-4］。
1.HA-软骨细胞复合物的特点：利用软骨细胞在各种载体上培养来修复鼻、耳廓、气管和关节面软骨等已有较多报道［3，4］，但用于骨修复者很少［5］。相关研究结果显示，目前有多种可供细胞培养的载体，如羟基磷灰石（HA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、几丁质（Chitin）等。
多孔磷酸钙陶瓷是目前商用人工骨的主要材料，其良好的生物相容性、骨生长传导性以及与骨组织相似的化学组成和晶体结构是其独特的优点。制备过程中加入一定量的添加剂，可增强增韧，承受载荷；根据需要可制成特定的大小和形状；通过人为控制制备技术，可得到不同HA∶TCP含量比例的产物，以控制材料的降解速度。另外，通过控制HA孔径、含孔率及晶体的结构也可控制其降解速度，是唯一与骨组织连接时无任何纤维组织间隔的材料。HA即是磷酸钙陶瓷的一种［6，7］。
从理论上讲，软骨细胞与其他细胞（如骨髓细胞、骨膜生发层细胞等）相比，有以下优势：(1)在成骨的时间和空间方面，软骨与骨组织的关系最为密切。在软骨内化骨过程中，软骨是骨组织的前身；(2)毋须像未分化间充质细胞那样，在成骨前需经过一定时间的诱导、分化；(3)取材方便，培养条件要求较低。
在软骨内化骨过程中，软骨组织与成骨有着十分密切的关系，但详细的功能机制还不清楚。近年来，一些实验证实软骨细胞有直接分泌骨基质蛋白的功能，也可直接分化为成骨细胞进行成骨活动［8-10］。目前认为软骨细胞在软骨内化骨过程中的作用有三个方面：（1）软骨细胞直接成骨；（2）软骨组织的残迹是必需的骨生长传导表面；（3）肥大软骨细胞及崩解的软骨组织释放成骨所必需的因子。将软骨细胞在HA孔隙中培养、扩增，若植入体内后继续存活，分泌基质，形成软骨组织，再转变为骨组织，可达到成骨的目的。同时为宿主提供骨生长的传导材料，使宿主和供体共同发挥成骨的功能，增加成骨能力。
2.HA作为细胞载体的可行性：HA具有极好的生物相容性，与不同含量TCP共同组成的材料具有不同的降解速度，从而可人为控制降解速度，其降解产物无任何毒副作用，可成为体内正常离子库的一部分。作为细胞培养的贴附底物，其Ca2+有助于细胞贴壁，因为细胞产生的纤连素（fibronectin）有特殊的Ca2+结合位点，促进细胞贴壁、生长［11］。多孔的立体结构使细胞从三维方向长入，其内部孔隙大大增加了贴壁面积，利于大量细胞长入。因此，HA表面可做为细胞培养的贴壁底物；软骨细胞可以长入多孔块状HA的孔隙内部，而且长入量随时间延长增加。
作者单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
参 考 文 献
1 Einhorn TA.Enhancement of fracrure-healing.J Bone Joint Surg(Am),1995,77：940-956．
2 Nerem RM.Tissue engineering in the USA.Med Biol Eng Comput,1992，30:8-12.
3 Kim WS,Vacanti JP,Cima L,et al.Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers.Plast Reconstr Surg,1994,94:233-237.
4 张文涛，卢世璧，王继芳，等.组织工程软骨移植修复兔膝关节软骨缺损.中华外科杂志，1998,36:591-593.
5 Iyoda K,Miura T,Nogami H.Repair of bone defect with cultured chondrocytes bound to hydroxyapatite.Clin Orthop，1993,(288):287-293.
6 Holmes R,Mooney V,Bucholz R,et al.A coralline hydroxyapatite bone graft substitute. Preliminary report.Clin Orthop，1984，(188):252-262.
7 Hollinger JO,Battistone GCB.Biodegradable bone repair materials.synthetic polymers and ceramics.Clin Orthop,1986,(207):290-305.
8 Moskalewski S, Malejczyk J.Bone formation following intrarenal transplantation of isolated murine chondrocytes：chondrocyte-bone cell transdifferentiation.Development,1989,107:473-480.
9 Roach HI,Erenpreisa J,Aigner T.Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell division and apoptosis.J Cell Biol,1995,121:483-494.
10 Scammell B,Roach HI.A new role for the chondrocyte includes direct bone formation by former chondrocytes.J Bone Min Res,1996,11:737-745.
11 Hambleton J,Schwartz Z,Khare A,et al.Culture surfaces coated with varioius implant materials affect chondrocyte growth and metabolism.J Orthop Res,1994,12:542-552.
更多相关文档请点击>>细胞(6192)培养的(5)软骨(303)羟基磷灰石类(1) |
|
