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bcl-2反义寡核苷酸促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究

作者:大江 | 时间:2014-9-28 08:59:14 | 阅读:488| 显示全部楼层

       郑军 姚榛祥

  【摘要】 目的 观察bcl-2反义寡核苷酸(oligonucleotides,ODN)对MCF-7细胞内bcl-2表达及细胞凋亡的影响。 方法 电转染法将合成的针对bcl-2 mRNA的反义ODN导入MCF-7乳腺癌细胞,用荧光显微镜、电镜、免疫组化法及流式细胞仪检测反义ODN对乳腺癌细胞凋亡、bcl-2表达及细胞周期的影响。 结果 经bcl-2反义ODN作用后,MCF-7细胞bcl-2基因表达降低、凋亡细胞数增多,作用前后差异有显著意义(P<0.05);G0~G1期细胞减少,而G2~M期、S期细胞增多。 结论 bcl-2反义ODN经电转染法导入乳腺癌细胞后,可以获得较好的瞬时表达,降低bcl-2功能,促进细胞凋亡。在肿瘤研究中,bcl-2可作为一个有用的靶基因。
  【关键词】 乳腺肿瘤  肿瘤细胞,培养的  癌基因  寡核苷酸类,反义  凋亡

Apoptosis increased by bcl-2 antisense ODN in MCF-7 cell line

ZHENG Jun, YAO Zhenxiang.
Department of General Surgery, Clinical College, Chongqing Medical University, Chongqing 400016.

  【Abstract】 Objective To study the effects of bcl-2 antisense oligonucleotides(ODN) on the expression of bcl-2 and apoptosis in MCF-7 cell line.  Methods Artificially synthesized bcl-2 specific antisense OND was introduced into MCF-7 cells by gene pulser electroprotocol. Fluorescence microscope, electron microscope, immunocytochemical staining assay, and FCM were used to detect the effects on cell apoptosis, expressional level of bcl-2 protein and cell cycle after transfecting bcl-2 antisense ODN. Results The number of apoptotic cells was increased and expression of bcl-2 protein was declined (P<0.05). FCM showed that the number of G0-G1 phase cells was decreased and the number of G2-M, S phase cells were increased. Conclusions The effective transient expression of bcl-2 antisense ODN can be obtained by gene pulser electroprotocol in MCF-7 cell, the function of bcl-2 gene was declined and the number of apoptotic cells was increased after transfecting bcl-2 antisense ODN. bcl-2 may be used as an useful target in tumor research.
  【Key words】 Breast neoplasms  Tumor cells, cultures  Oncogenes  Oligonucleotides,antisense
Apoptosis

  我们采用电转染技术将bcl-2反义寡核苷酸(ODN)导入MCF-7乳腺癌细胞内,探讨其对肿瘤细胞bcl-2基因表达、细胞凋亡及细胞周期的影响。

材料与方法
  1.MCF-7乳腺癌细胞株的培养:将MCF-7乳腺癌细胞株置于含体积分数0.1新生小牛血清、160 mU/L人胰岛素的RPMI 1640培养基中培养,37 ℃、5% CO2孵箱内贴壁生长3~4代后取指数生长期细胞,以每瓶(1×105)~(2×105)细胞数种于50 ml培养瓶内,加入无血清RPMI 1640培养基培养24小时,使细胞同步化后,再加入完全培养基培养24小时,待作转染用。
  2.bcl-2反义ODN制备:按文献[1]方法。
  3.bcl-2反义ODN导入MCF-7细胞方法:仪器为Bio-Rad公司基因脉冲电转染仪。选择生长良好的细胞至50%~75%满底后,按文献[2]的方法将bcl-2反义ODN导入MCF-7细胞,再分别转入24孔板(每组转3孔)及培养瓶内,37 ℃、5%的CO2孵箱中培养48小时待检测。
  本实验共分为5组。A组:无关ODN对照组;B组:加入反义ODN 10 μg(12.5 μg/ml);C组:加入反义ODN 20 μg(25 μg/ml);D组:加入反义ODN 30 μg(37.5 μg/ml);E组:空白对照组。
  4.反义ODN处理前后凋亡细胞的检测:参照张亚历等[3]的方法计数凋亡细胞,将吖啶橙(AO)配成100 μg/ml的贮存液,用时从培养瓶消化约95 μl的转染细胞悬液,加5 μl的AO贮存液混匀后作细胞点片,加盖玻片后直接在荧光显微镜下观察细胞。核固缩为圆点、新月形、杆状者为凋亡细胞;各实验组随机数200个细胞/高倍视野,计算凋亡细胞的百分率,每组均重复转染3次,分别观察后取均值。另各组取1.0×105个细胞悬液,2?000 r/min离心10分钟,弃上清液,细胞沉淀用2%戍二醛固定2小时送电镜检查,观察凋亡细胞及凋亡小体。
  5.bcl-2蛋白表达的检测:每实验组各取1孔贴壁生长较好的转染细胞,固定后分别进行SP法免疫组化染色,显微镜下随机计数200个细胞/高倍视野,观察bcl-2蛋白表达阳性细胞的比率,每组仍为重复转染3次,分别检测后取均值。
  6.细胞周期的检测[4]:每组各取1例,用0.2%胰酶将贴壁细胞消化为单细胞,再以培养基中和胰酶,室温1000 r/min离心5分钟,弃上清液,用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次。用PBS配制成5×104个细胞/ml的悬液,2小时内用流式细胞仪(FCM)测试细胞周期。
  7.统计方法:用SAS软件,数据用t检验

结果
  1.bcl-2反义ODN导入后MCF-7细胞凋亡状态的变化:经电转染后A组及E组仅有较少的凋亡细胞,两者差异无显著意义(P>0.05);而B、C、D各组凋亡细胞明显增高,与无关对照组比较差异有显著意义(P<0.05,表1);但B、C、D组之间差异无显著意义(P>0.05)。电镜下见凋亡细胞包膜皱缩,表面有脱落小体,胞浆基质浓缩,电子密度增高,胞质内有大小不一的空泡,但细胞器正常。可见核断裂、并皱缩、体积缩小及染色质凝集的凋亡小体。

表1 各组凋亡细胞百分率(±s)


分 组 凋亡细胞(%) t P值
A组 11.50±3.90△
1.25 >0.05
B组 33.33±4.07? 6.71 <0.05
C组 33.00±5.51? 5.41 <0.05
D组 35.00±10.50? 3.63 <0.05
E组 8.50±1.51  

   注:△与E组比较P>0.05,?与A组比较P<0.05
  2.bcl-2反义ODN处理前后乳癌细胞内bcl-2蛋白表达:无关ODN的A组细胞内bcl-2蛋白表达的阳性率为(81.16±9.22)%,空白对照的E组细胞内bcl-2为(79.25±6.60)%,两者差异无显著意义(P>0.05);而经不同浓度bcl-2反义ODN转染后的B组bcl-2为(43.00±12.12)%、C组为(21.50±4.58)%、D组为(22.83±9.29)%,均较A组明显减少,差异有显著意义(P<0.05),尤以C组和D组降低明显。
  3.bcl-2反义ODN作用后细胞周期的变化:结果显示bcl-2反义ODN作用后,G0~G1期细胞数下降,G2~M期及S期细胞数增多(表2)。

表2 反义ODN作用前后各组细胞周期变化(%)


分 组 细 胞 周 期
G0~G1 G2~M S
A 组 71.03 4.50
24.43
B组 60.17 10.39 29.44
C组 56.25 13.09 30.66
C组 52.49 15.38 32.13


讨论
  1.bcl-2反义ODN对肿瘤细胞凋亡的影响:细胞的凋亡如同细胞的增殖一样受多种基因,如bcl-2、c-myc、p53等调控[5]。Hockenbery等[6]认为bcl-2基因族在细胞凋亡调控中的作用最具重要意义,而且近年研究也发现bcl-2在肿瘤中的高表达可以使肿瘤细胞耐药性增高。因此,有学者研究用针对bcl-2 mRNA的反义ODN抑制bcl-2基因功能。如Keith等[7]用bcl-2反义ODN作用于急性髓系白血病细胞,发现肿瘤细胞生长受抑制。本研究结果显示:MCF-7乳癌细胞通过电转染法导入bcl-2反义ODN后肿瘤细胞凋亡增加,并随着导入ODN浓度的增加凋亡细胞数增多,至37.5 μg/ml时达最高峰,同时bcl-2蛋白表达下降。因此采取电转染bcl-2反义ODN方式可以获较好的瞬时表达、促进肿瘤细胞凋亡。
  2.bcl-2 反义ODN对肿瘤细胞周期的影响:bcl-2基因除抑制细胞凋亡、延长细胞生存外, 近年研究表明该基因还具有细胞周期抑制功能。若bcl-2过度表达,可明显地促使细胞从自我更新复制进入G0期。经电转染方式将bcl-2反义ODN 导入MCF-7细胞,48小时后FCM检测发现G0~G1期细胞含量由对照组的71.03%降到52.49%,而G2~M和S期细胞则分别从4.5%、 24.43%增至15.38%、32.13%。表明bcl-2反义ODN转染导致bcl-2抑制细胞周期的功能降低,使处于G0期的细胞重新进入细胞周期循环,是肿瘤细胞凋亡的重要机制之一。bcl-2可以作为肿瘤基因治疗中有用的靶基因。
作者单位:400016 重庆医科大学临床学院普外

参考文献
 1 张涛,孙秉中,王成济,等.反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞中bcl-2基因表达的研究.第四军医大学学报,1996,17:132-134.
 2 卢圣栋,主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993.396-397.
 3 张亚历,姜泊,周殿元.编程性细胞死亡及研究方法.细胞生物学杂志,1995,17:127-129.
 4 司徒镇强,吴军正,主编.细胞培养.北京:世界图书出版公司,1996.300-301.
 5 Korsmeyer SJ. bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulations of cell death. Blood, 1992,80:879-886.
 6 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death.Nature, 1990,348:334-336.
 7 Keith FJ, Bradbury DA, Zhu YM, et al. Inhibition of bcl-2 with antisenes oligonucleotides induces apoptosis and increases the sensitivety of AML blasts to Ara-C. Leukemia, 1995,9:131-138.




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