大江 发表于 2014-10-1 14:58:25

神经生长因子对脊髓损伤后c-fos mRNA和c-fos蛋白表达的影响

         
       曹晓建 罗永湘

  为进一步研究神经生长因子(NGF)保护脊髓损伤组织的作用机制,进行了c-fos基因的原位杂交和免疫组化研究。
  一、材料与方法
  实验分组:Wistar大鼠45只,雌雄不分,体重200~250 g。随机分成3组:正常对照组(鼠数=5),不损伤脊髓,作为c-fos基因的正常对照;等渗盐水组(鼠数=20),脊髓损伤后经蛛网膜下腔导管注入盐水;NGF组(鼠数=20),同样经蛛网膜下腔导管注入NGF。
  脊髓损伤模型的建立:以质量浓度为3 g/L的戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉,以T8棘突为中心,取背部后正中切口长约5 cm,切开皮肤、皮下组织,咬除T8棘突及全椎板,以脊髓为中心显露直径为3 mm的图形区,作为脊髓损伤区。再咬除T9~T10的棘突及左侧椎板,显露硬脊膜,作为蛛网膜下腔置管区。用Allen装置,选用10 g×2.5 cm致伤冲量损伤T8脊髓,成功后位于T10处硬脊膜偏离后正中血管左侧剪开一小洞,将细塑料管向脊髓损伤方向蛛网膜下腔插入3 mm,导管与椎旁组织及皮肤固定。
  术后处理:NGF组分别于术后即刻、10,30分钟及1,2,3,4小时经导管各注入24μl NGF溶液(含NGF 60μg,由武汉生物制品研究所提供)。各组于术后15分钟及1,2,4小时每组分别取5只动物断头处死取材。切取损伤区脊髓组织,中性甲醛固定,脱水,石蜡包埋,切片。等渗盐水组在同时间内注入等量的等渗盐水作为对照,取材同NGF组。
  原位杂交:用地高辛标记探针c-fos探针进行标记及杂交,结果用TJTY-300图像分析仪进行图像分析。免疫组化染色:按SABC法常规操作,结果判定同原位杂交。统计学处理:所有结果均以±s表示,组间差异比较采用t检验。
  二、结果
  1.c-fos mRNA原位杂交结果见表1。
  2.c-fos蛋白表达结果见表1。

表1 c-fos mRNA和c-fos蛋白在脊髓损伤后的表达(±s)

组别 鼠数 术后时间 c-fos mRNA c-fos蛋白
正常对照组 5
即刻
1.04±0.48
4.87±0.61

等渗盐水组 5
15min
4.09±0.19
5.94±0.93

  5 1h 10.66±1.88 8.29±1.20
  5 2h 7.18±0.23 16.76±1.09
  5 4h 5.34±0.42 16.76±1.09
NGF组 5 15min 3.21±0.59** 5.18±0.68
  5 1h 8.56±0.34** 6.79±0.31**
  5 2h 6.37±0.43** 12.96±0.91**
  5 4h 4.38±0.99** 9.84±0.77**
  与等渗盐水组比较: **P<0.01
讨 论
  本实验结果显示,脊髓损伤后,脊髓神经c-fos mRNA和c-fos蛋白表达明显增高,c-fos可能参与了脊髓神经元损害及继发性损害。以往很多研究证明,c-fos的作用是经兴奋性氨基酸(EAA)诱导产生,并与钙密切相关。脊髓损伤后,EAA水平显著上升。笔者以往研究已证实NGF能抑制损伤后EAA的升高效应。本研究证实,NGF能显著抑制脊髓损伤后c-fos基因表达,从而保护损伤的神经组织。脊髓损伤后c-fos mRNA和c-fos蛋白表达高峰时间不一致,这是由于c-fos蛋白表达从转录到翻译的时间差所致。很多研究也发现了这一现象。一般认为,高峰可延迟1~4小时。
  NGF的作用机制可能是由于NGF抑制损伤后EAA的活性升高,间接抑制c-fos基因表达,从而保护神经组织。

*本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39470701)

作者单位:曹晓建 210029 南京医科大学第一附属医院骨科;
     罗永湘 同济医科大学附属同济医院




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